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介紹                                                

通常從人體活檢中采集并保存福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)樣本，用于組織學研究。福爾馬林固定法通過將核酸和蛋白質的細胞內容物交聯并將樣品包裹在蠟中，使材料可在室溫下保存多年。世界各地的生物中心和研究人員儲存了數以百萬計的FFPE樣本。

隨著文庫準備和下一代測序技術的進步，這些樣本中保存的核酸現在可以被恢復，以產生重要的基因組信息。因此，存檔的FFPE樣品成為了豐富而珍貴的研究材料來源。越來越多的研究實驗室利用zinq FFPE樣本來分析和了解與疾病相關的基因和突變多種因素導致了從FFPE分離出的DNA質量的變化，包括保存過程中發生的核酸化學變化，保存過程缺乏標準化，以及存檔樣本的年齡。從FFPE樣本中分離出的DNA質量較低，有望產生低復雜度的NGS文庫，因為盡管分離出的DNA有明顯的濃度，但DNA的“可用”量很低為了創建具有大多樣性的庫，選擇正確的庫準備方法是至關重要的。ThruPLEX technoloqy使用莖環適配器，這樣就不需要中間的清理步驟，維持單管工作流程，并保持庫的復雜性。后的擴增利用了所有修復和連接的分子，結果在文庫中發現了大量的*分子(Fiqure 1)。另一個好處是，創建文庫的時間減少到大約兩小時。ThruPLEX DNA-seq庫也可以很容易地與其他應用程序集成，如目標富集。輸入材料的高度多樣性保證了捕獲將產生文庫的優良覆蓋整個基因組的目標區域

 Fiqure 1.采用ThruPLEX技術。這個工作流程使用了一個三步單管反應，開始的片段雙鏈DNA，經過一個高效的修復過程。接下來，莖環適配器被鈍端連接到修復的輸入DNA上。使用高保真聚合酶對這些分子進行擴展和擴增，使其包括條形碼，從而生成索引化的Illumina NGS庫。

 在本技術說明中，我們演示了我們的通用文庫準備試劑盒——ThruPLEX DNA-seg試劑盒與ffpe衍生的DNA一起使用時的性能和特點。對于非FFPE樣本，標準方案建議的輸入范圍為0.05-50 ng，在此，我們將輸入量增加到100 ng，以補償FFPE樣本中受損的DNA。我們的結果表明，在Ilumina平臺上從ffpe提取的DNA中制備NGS文庫時，ThruPLEX DNA-seq技術是一個很好的選擇。與其他庫準備工具包相比，它提供了更多樣化的庫，同時小化了GC偏差。我們進一步演示了ThruPLEX DNA-Seq試劑盒如何與Agilent SureSelect富集試劑盒成功集成，對FFPE樣品進行靶向測序。

 結果                                                

ThruPLEX DNA-seg技術生產的文庫比NEB Next Ultra或KAPA Hyper試劑盒更具多樣性。平均而言，ThruPLEX library產生的估算庫大小比NEB Next Ultra大80%，比KAPA Hyper大240%，表明ThruPLEX library中存在更多的*分子(圖2)。正如預期的那樣，ThruPLEX DNA-seq產生的重復讀取不到2%。與NEBNext Ultra相似，而KAPA Hyper的重復reads范圍大(3-6%)(圖2)。對文庫分子插入量的檢查顯示，ThruPLEX DNA-Sea試劑盒產生的插入量為190 bp。大約相當于KAPA Hyper庫，但比NEBNext Ultra的150-bp插入長約27%(圖2)。在對配對端讀取時，插入長度越長往往越有利，因為有更多的不重疊讀取，可以更好地表示原始序列信息。

 圖2. 高度多樣化的庫。與其他測試試劑盒相比，ThruPLEX DNA-seq文庫提供了更多*的分子(上圖)和更少的重復(上圖)。下圖:ThruPLEX DNA-seq創建的分子平均插入尺寸比NEB Next Ultra長-27%。比較了三種試劑盒制備的文庫的GC覆蓋率。ThruPLEX DNA-Seg試劑盒產生了平衡的GC覆蓋率(圖3)。

圖3. 均一的GC的覆蓋度。由ffpe衍生的DNA制成的DNA序列分析文庫覆蓋了整個人類基因組。然后使用Agilent ClearSeq Human DNA Kinome面板對ThruPLEX DNA-seg文庫進行富集。在每種情況下，庫的質量都很高，如圖4中的數據所示。通過測序深度測量的Kinome覆蓋率與樣本有關，并在目標面板覆蓋40-50X的情況下進行測序。所有樣品上餌覆蓋率均大于70%

圖4. 使用Agilent ClearSeq Human DNA Kinome面板豐富了ThruPLEX DNA-seq文庫的目標測序指標。

 結論                                                

FFPE樣本的序列可能非常具有挑戰性。在固定過程中引入的不同程度的化學損傷減少了可用于構建文庫的“優質”材料的數量。為此，在這一系列實驗中，我們修改了標準的ThruPLEX DNA seq協議，將輸入量增加到100ng。這使我們能夠創建更多樣化的庫(庫復雜性高80-240%)，并且比其他庫準備試劑盒包含更少的擴增。

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